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可能的原因及對應(yīng)的解決方案如下:
酶失活或在反應(yīng)體系中未加入酶。Taq DNA 聚合酶因保存或運輸不當(dāng)而失活,往往通過更換新酶或用另一來源的酶以獲得滿意的結(jié)果。
模板含有雜質(zhì)。特別是對甲醛固定及石蠟包埋的組織常含甲酸,造成 DNA 脫嘌呤而影響 PCR 的結(jié)果。
變性溫度是否準(zhǔn)確:PCR 儀指示溫度與實際溫度是否相符,過高酶在前幾個循環(huán)就迅速失活;過低則模板變性不底。
反應(yīng)系統(tǒng)中污染了蛋白酶及核酸酶,應(yīng)在未加 Taq 酶以前,將反應(yīng)體系 95℃ 加熱 5~10 分鐘。
引物變質(zhì)失效。人工合成的引物是否正確。是否純化,或因儲存條件不當(dāng)而失活。
引物錯誤。利用 BLAST 檢查引物特異性或重新設(shè)計引物。
DNA 凝膠電泳時加入陽性對照,確保不是 DNA 凝膠和 PCR 程序的問題。
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